23价肺炎球菌多糖疫苗
23 Jia Feiyanqiujun Duotang Yimiao
23-valent Pneumococcal Polysaccharide Vaccine
本品系采用1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎链球菌分别进行液体培养，经提取和纯化获得荚膜多糖抗原后稀释合并制成。用于预防由上述23种血清型肺炎链球菌引起的肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等疾病。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。
2.1.1 名称及来源
生产用菌种为23种血清型肺炎链球菌菌种（1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型），来自中国医学细菌保藏管理中心或其他经批准的菌种。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。
2.1.3 种子批的传代
主种子批启开后至工作种子批，传代应不超过5代；工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过5代。
2.1.4 种子批的检定
2.1.4.1 培养特性
菌种接种于适宜的培养基上，于35~38℃二氧化碳环境中培养16~24小时，长出圆形、湿润、灰白色或灰色的菌落，并且有α-溶血现象。菌苔易取下，在0.85%~0.90%氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。
2.1.4.2 染色镜检
应为革兰氏阳性球菌，有荚膜，可呈链状排列。
2.1.4.3 生化反应
除另有规定外，应发酵葡萄糖、菊糖、棉子糖、蜜二糖，不发酵山梨醇。
2.1.4.4 胆汁溶菌试验
加数滴10%脱氧胆酸钠溶液于菌液中，肺炎链球菌应被溶解。
2.1.4.5 奥普托欣试验
奥普托欣纸片周围应出现抑菌圈，且直径大于14mm。
2.1.4.6 荚膜肿胀试验
将菌苔分别加入到对照区的0.85%~0.90%氯化钠溶液和阳性区的对应型特异性肺炎链球菌抗血清中，与对照区菌体相比较，阳性区菌体周围应可见明显无色荚膜。
2.1.5 种子批的保存
种子批保存应符合批准的要求。
2.2 原液
2.2.1 生产用种子
启开工作种子批菌种，经适当传代、染色镜检合格后接种于培养基上，制备数量适宜的生产用种子。
2.2.2 生产用培养基
采用肺炎球菌半综合液体培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有对人体有害或过敏原物质。
2.2.3 培养
采用培养罐液体培养。在培养过程中取样涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
2.2.4 收获及杀菌
于对数生长期的后期收获，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，在收获的培养液中加入脱氧胆酸钠杀菌，杀菌条件以确保杀菌完全又不损伤其多糖抗原为宜。
2.2.5 多糖的粗制
2.2.5.1 超滤浓缩
离心去菌体后的上清，超滤浓缩。
2.2.5.2 收集上清液
根据不同血清型多糖特点，除另有规定外，其他型别在超滤浓缩液中加入适宜试剂，调pH值，加入乙醇至适宜浓度，离心收集上清液。
2.2.5.3 沉淀粗糖
根据不同血清型多糖特点，除另有规定外，取上清液或超滤浓缩液，加入乙酸钠至适宜浓度，调pH值，加乙醇至适宜浓度，沉淀多糖；离心收集沉淀；经有机溶剂洗涤、真空干燥后收获粗制多糖，或按照经批准的工艺沉淀粗糖。
2.2.6 多糖的精制
2.2.6.1 去除蛋白质
采用冷酚法或经批准的方法去除蛋白质。
2.2.6.2 去除核酸
除另有规定的血清型别外，采用乙醇沉淀法或经批准的方法去除核酸。
2.2.6.3 沉淀精糖
经有机溶剂洗涤，真空干燥，收获精制多糖，或经批准的方法进行精糖沉淀。
2.2.7 精制多糖检定
按3.1项进行。
2.2.8 保存及有效期
于-20℃以下保存。自收获杀菌之日起，疫苗总有效期应不超过60个月。
2.3 半成品
2.3.1 配制
分别取各单价精制多糖或各单价多糖原液适量，合并稀释配制成23价肺炎球菌多糖疫苗，使各单型精制多糖终浓度为50μg/ml，除菌过滤后分装。
2.3.2 检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分包装及贮运管理”的有关规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分包装及贮运管理”的有关规定。
2.4.3 规格
每1次人用剂量0.5ml，含23价肺炎球菌荚膜多糖各25μg。
2.4.4 包装
应符合“生物制品分包装及贮运管理”的有关规定。
3 检定
3.1 单型精制多糖检定
3.1.1 鉴别试验
采用免疫双扩散法（通则3403），各单型多糖应与其相应的特异性抗血清产生明显沉淀线；或用速率比浊法（3.3.2），应可测出各单型多糖含量。
3.1.2 化学检定
3.1.2.1 固体总量
依法测定（通则3101），各型精制多糖干燥至恒重。
3.1.2.2 蛋白质含量
依法测定（通则0731），各型蛋白质含量限度见附表。
3.1.2.3 核酸含量
依法测定（通则0401），核酸在260nm波长处的吸收系数（
）为200，各型核酸含量限度见附表。
3.1.2.4 O-乙酰基含量
依法测定（通则3117）1型和11A型精制多糖的O-乙酰基含量，含量限度见附表。
3.1.2.5 磷含量
依法测定（通则3103）或采用经批准的其他方法，各型磷含量限度见附表。
3.1.2.6 糖醛酸含量
依法测定（通则0401）或采用经批准的其他方法。
精确称定D-糖醛酸10mg，加水溶解并定容至200ml，制备100μg/ml糖醛酸对照品溶液。[1]取供试品，用水稀释成糖醛酸浓度低于50μ/ml的供试品溶液。
精确量取糖醛酸对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分别于玻塞试管中，加水补至1ml/管（糖醛酸含量分别为0μg、10μg、20μg、30μg、40μg和50μg），在搅拌状态下滴加0.955%硼酸盐-硫酸溶液5ml，加塞，于100℃水浴15分钟，冷却至室温后，加0.2ml 0.125%的咔唑-乙醇溶液，加塞，于100℃水浴15分钟，冷却至室温后，于530nm波长处读取各管的吸光度值，同时以空白管（糖醛酸含量为0）作为对照。
精确量取供试品溶液1ml于玻塞试管中，平行测定两管，自“在搅拌状态下滴加0.955%硼酸盐-硫酸溶液5ml”起同法操作。
以糖醛酸对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的吸光度值作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度值带入直线回归方程中，根据稀释倍数计算求出供试品的糖醛酸含量，再以多糖干重计算出糖醛酸的百分含量。
1、2、3、5、8、9N、9V、22F型精制多糖的糖醛酸含量限度见附表。
3.1.2.7 甲基戊糖含量
依法测定（通则0401）或采用经批准的其他方法。
精确称定甲基戊糖（鼠李糖）0.1g，加水溶解定容至100ml，摇匀，制备1mg/ml甲基戊糖对照品贮备液（-20℃保存，有效期3个月，临用前50倍稀释，制得20μg/ml甲基戊糖对照品溶液）。
精确量取20μg/ml甲基戊糖对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分别于玻塞试管中，补水至1ml，以对照品管中的空白管（甲基戊糖含量为0）作为对照，于冰浴中，在连续搅拌下滴加预冷的硫酸溶液4.5ml，加塞，温暖试管至室温后，于100℃水浴至少5分钟，冷却至室温，于各管中加3%巯基丙氨酸（半胱氨酸）盐酸溶液0.1ml，混合均匀，加塞，置室温放置1~2小时，各管于396nm和430nm波长处测定吸光度A值，同时以空白管作为对照。
取供试品，用水稀释成甲基戊糖浓度低于20μg/ml的溶液。精确量取1.0ml供试品溶液于玻塞试管中，平行测定两管，自“于冰浴中，在连续搅拌下滴加预冷的硫酸溶液4.5ml”起同法操作。
以对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的校正吸光度值（A396~A430nm）作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的校正吸光度值（A396~A430nm）带入直线回归方程中，根据稀释倍数计算求出供试品的甲基戊糖含量，再以多糖干重计算出甲基戊糖的百分含量。
2、6B、7F、17F、18C、19A、19F、22F、23F型精制多糖的甲基戊糖含量限度见附表。
3.1.2.8 氨基己糖含量
依法测定（通则0401）或采用经批准的其他方法。
精密称定D-盐酸氨基葡萄糖或葡糖胺对照品适量，制成氨基己糖含量为500μg/ml的溶液。精密量取500μg/ml葡糖胺对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml，分别置于20ml具塞玻璃试管中。
水解 加适当浓度HCl溶液1ml，加塞并于100℃水浴加热。冷却水解溶液至室温，加指示液（0.5%酚酞乙醇溶液或0.5%麝香草酚酞乙醇溶液），混合均匀，用4mol/L NaOH溶液中和水解溶液至变色，然后滴加1mol/LHCl溶液，直至溶液无色，加水至10ml，此为中性水解溶液。精密量取1ml中性水解溶液于玻塞试管中，平行测定两管，于各管中分别加1ml乙酰丙酮试剂或1ml的1:50（体积比）乙酰丙酮-碳酸钠溶液，加塞，于90℃水浴加热45分钟，冷却溶液至室温，各管中加入无水乙醇2.5ml，混匀，各管缓慢加入1.0ml对二甲氨基苯甲醛溶液，混匀。补加无水乙醇至10ml，混匀，加塞，于室温避光放置1~1.5小时，于530nm波长处测定吸光度值，同时以标准管中的空白管作为对照。
精密量取1.0ml供试品溶液于玻塞试管中，自“加适当浓度HC1溶液1ml”起同法操作。
以对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的吸光度值作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度值带入直线回归方程中，根据稀释倍数计算求出供试品的氨基己糖含量，再以多糖干重计算出氨基己糖的百分含量。
4、5、9N、9V、10A、12F、14、15B、19A、19F、20型精制多糖的氨基己糖含量限度见附表。
3.1.2.9 总氮含量
依法测定（通则0704）或采用经批准的其他方法，各型总氮含量限度见附表。
3.1.2.10 分子大小测定
第一法 仪器法
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数（KD）。1、2、3、4、7F、8、9N、12F、14、18C、19A、19F和23F型多糖采用琼脂糖4B或琼脂糖CL-4B凝胶过滤法测定；5、6B、9V、10A、11A、15B、17F、20、22F和33F型多糖采用琼脂糖2B或琼脂糖CL-2B凝胶过滤法测定。
试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定同通则3419第二法。
测定法 取供试品约1ml（含多糖抗原2~5mg），加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15~20ml，用示差折光检测器检测，记录色谱图，即得。
按下式计算：
KD=（Ve-V0）/（Vi-V0）
式中 KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
V0为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
第二法 糖含量测定法（蒽酮硫酸法）
试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定同通则3419第一法。
测定法 取供试品约1ml（含多糖抗原2~5mg），加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15~20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3~5ml，照下述方法测定每管洗脱液的糖含量。以供试品每管洗脱液的糖含量为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。
按下式计算：
KD=（Ve-V0）/（Vi-V0）
式中 KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
V0为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
糖含量测定（蒽酮硫酸法）以0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0~100μg/ml葡萄糖标准品溶液。将硫酸225ml加入75ml 0.85%~0.90%氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.3g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度葡萄糖标准品溶液以及各管洗脱液，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，置沸水浴20分钟后再于40℃水浴10分钟后，在波长620nm处测定吸光度，以葡萄糖标准品溶液浓度对应其吸光度，用直线回归法计算糖含量。
【附注】过柱操作在10~20℃进行。
各型多糖分子KD值见附表。
3.1.2.11 有机溶剂残留量
依法检查（通则0861）或采用经批准的其他方法，应符合批准的要求。
也可在3.3“成品检定”项下进行。
3.1.3 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），各型多糖细菌内毒素含量应不高于1EU/μg。
3.2 半成品检定
无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3 成品检定
3.3.1 鉴别试验
按3.1.1项方法进行。
3.3.2 各型多糖含量测定
采用免疫化学法（通则3429）速率散射比浊法测定。取多糖标准品制备标准品溶液，与多糖特异性血清反应，通过浊度仪获取标准曲线，CV应小于15%，R值应大于0.985。将供试品稀释至适宜浓度，与多糖特异性血清反应，通过浊度仪检测各型多糖含量，CV应小于15%。各型多糖含量应为（50±15）μg/ml（或应为标示量的70%~130%）。
3.3.3 物理检查
3.3.3.1 外观
应为无色透明液体。
3.3.3.2 装量
依法检查（通则0102），应不低于标示量。
3.3.4 化学检定
3.3.4.1 pH值
依法测定（通则0631），应符合批准的要求。
3.3.4.2 渗透压摩尔浓度
依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
3.3.4.3 苯酚含量
如添加苯酚作抑菌剂，依法测定（通则3113），应符合批准的要求。
3.3.5 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3.6 异常毒性检查
依法检查（通则1141），应符合规定。注射剂量为每只小鼠0.5ml，含1次人用剂量；每只豚鼠5ml，含10次人用剂量。
3.3.7 热原检查
依法检查（通则1142）。注射剂量按家兔体重每kg注射1ml，含每型多糖2.5μg，应符合规定。
3.3.8 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1次人用剂量应不高于25EU。
4 保存、运输及有效期
于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月。
5 使用说明
应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。
审核人：张勇、liufei213
