9305 中药中真菌毒素测定指导原则

9305 中药中真菌毒素测定指导原则
      真菌毒素（mycotoxin）是真菌产生的次级代谢产物。某些中药在种植、储存等过程中易产生一些真菌毒素，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和展青霉素等，对人体具有毒性，有必要加强相关真菌毒素的控制。
      本指导原则用于中药中真菌毒素的测定。
    基本原则
      一、中药中真菌毒素的分类
      真菌毒素是由各种各样的真菌菌核所产生的。曲霉属、镰刀菌属和青霉属包括了绝大多数的产毒真菌。与曲霉属相关的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A等；与镰刀菌属相关的真菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）和伏马毒素等；与青霉属相关的真菌毒素主要包括展青霉素和桔青霉素等。
      二、监控品种
      由于各类真菌毒素的发生毒性的机理不同，容易受污染的对象也有所不同。因此，应选取容易受污染的中药品种进行相应毒素检测方法的开发。粮谷类、种子类、油性成分多的品种应注意黄曲霉毒素的检测；与粮谷类有类似基质的中药材应注意赭曲霉毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的检测，如淡豆豉、薏苡仁、白扁豆等；酸性果实类中药应注意展青霉素的检测，如枸杞子、乌梅、酸枣仁等。处方中含有易污染的药材以及生粉投料的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测。
      三、测定方法
      目前真菌毒素的检测方法有薄层色谱法、酶联免疫测定法、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法等。薄层色谱法主要用于初筛，酶联吸附免疫法适宜大批样品集中检测，胶体金免疫层析方法适合现场单个或少数样品即时检测。高效液相色谱法专属性较强，重现性较好，假阳性率较低。液相色谱质谱联用法可以实现多成分同时检测，解决色谱分离不完全及假阳性的情况。本指导原则主要提供了高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法的参考方法。
      在建立中药中真菌毒素的测定方法时，应符合药品质量标准分析方法验证指导原则（通则9101）。
      四、限值拟定
      真菌毒素的限量可结合毒性数据、国内外相关行业的限度标准以及中药的用法用量进行拟定。
    基本内容
      一、高效液相色谱法
      高效液相色谱法较多应用于单一成分真菌毒素的分析或者同种类真菌毒素的多成分分析。
      1.色谱条件与系统适用性试验
      应根据待测真菌毒素的理化性质选择适宜的固定相和流动相，多成分测定时可采用流动相梯度洗脱，以达到良好分离效果。固定相常用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，可根据情况选择小粒径或较长的色谱柱以提高分离度。常用的流动相为不同比例的甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，以荧光检测器或者二极管阵列检测器进行测定。
      如赭曲霉毒素A可以乙腈-2%冰醋酸溶液（49：51）为流动相，荧光检测器检测（激发波长333nm，发射波长477mn）进行测定；呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）可以甲醇-水（20：80）为流动相，紫外检测器（检测波长为220mn）进行测定；玉米赤霉烯酮可以乙腈-水（50：50）为流动相，荧光检测器（激发波长232nm，发射波长460nm）进行测定。
      2.对照品溶液的制备
      应根据各种真菌毒素的理化性质，以保证溶解性和稳定性为原则，选择合适的溶剂溶解并配制合适的浓度作为贮备液。常用的溶剂为甲醇、乙腈。对照品贮备液一般可于冰箱冷藏保存1～3个月。
      临用前需采用合适的溶剂将贮备液稀释成合适浓度的工作溶液，一般选用与供试品溶液中相似比例的有机溶剂进行配制。
      如赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮可用甲醇溶解稀释；呕吐毒素可用50%的甲醇溶液溶解稀释；展青霉素可用2%乙腈溶液（用乙酸调节pH值至2）溶解稀释。
      3.供试品溶液的制备
      应采用快速、简单、高效的提取方式进行待测真菌毒素的提取，常见的提取方式有振摇，超声以及高速匀浆等。提取液一般需进一步净化富集，如采用免疫亲和柱或者HLB固相萃取小柱对待测真菌毒素进行吸附与洗脱，其中免疫亲和柱由于专属性吸附待测真菌毒素，净化效果较好；HLB固相萃取小柱需通过调整洗脱溶剂极性，分段进行待测物的洗脱与收集，可用于多成分的提取净化。其他毒素净化柱可用于吸附样液中的脂类、蛋白类等杂质，操作简便，但净化效果相对较差。
      如赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮可分别采用80%甲醇溶液、水、90%乙腈溶液进行提取，提取液再分别采用相应的免疫亲和柱进行净化。展青霉素可用乙腈水溶液进行提取后，用毒素净化柱进行处理。
      4.样品测定及结果判断
      真菌毒素的测定一般采用标准曲线法，当供试品色谱中出现与对照品保留时间相同的色谱峰时（当采用二极管阵列检测器时，其紫外-可见吸收光谱与对照品光谱也应匹配），可基本判断检出相应的毒素，通过标准曲线计算相应的含量。
      样品测定一般需同时进行添加回收实验和灵敏度实验，如有可能，应使用有证标准物质进行质量控制。中药基质复杂，提取效率各不相同，必要时可加入同位素内标进行校正。
      5.注意事项
      应尽量在每针进样后以高比例有机相冲洗色谱柱，在色谱柱前加预柱或保护柱，以延长色谱柱寿命。
      应注意本法测定时出现的假阳性情况或色谱图有干扰时，应通过色谱-质谱联用法予以确认。
      在本方法未检出毒素的情况下，也应注意假阴性情况，结合方法检测限，综合判断，必要情况下应采用更为灵敏的方法进行检测。
      二、高效液相色谱-质谱联用法
      当出现基质干扰或含量较低难以采用高效液相色谱法准确测定时，应采用高效液相色谱-质谱联用法测定，该方法还可用于不同种类的真菌毒素同时测定，实现真菌毒素的高通量快速筛选及含量测定。
      1.色谱条件与系统适用性试验
      流动相组成的选择应注意待测毒素在质谱中的采集模式，以提高离子化效率。应根据仪器的具体情况，选择最佳的离子采集模式，并对质谱检测参数进行优化达到最佳。采用三重串联四极杆质谱作为检测器时，应选择多对特征性的离子对通道，并针对性优化设定最佳碰撞能量等
      如赭曲霉毒素A可以甲醇为流动相A，以0.01%甲酸为流动相B，按下列梯度洗脱：0～5分钟，A：55%→90%；5～7分钟，A：90%；7～7.1分钟，A：90%→55%；7.1～10分钟，A：55%。电喷雾离子源（ESI）负离子模式下选择质荷比（m/z）402.1→358.1作为定量离子对，402.1→211.1作为定性离子对进行检测。呕吐毒素可以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下列梯度洗脱：0～5分钟，A：10%→40%；5～6分钟，A：40%→90%；6～7分钟，A：90%；7～7.1分钟，A：90%→10%；7.1～10分钟，A：10%。电喷雾离子源（ESI）负离子模式下选择质荷比（m/z）295.1→265.1作为定量离子对，295.1→138.0作为定性离子对进行检测。玉米赤霉烯酮可以甲醇为流动相A，以0.01%甲酸溶液为流动相B，按下列梯度洗脱：0～5分钟，A：55%→90%；5～7分钟，A：90%；7～7.1分钟，A：90%→55%；7.1～10分钟，A：55%。电喷雾离子源（ESI）负离子模式下选择质荷比（m/z）317.1→174.9作为定量离子对，317.1→130.8作为定性离子对进行检测。展青霉素可以乙腈为流动相A相，以水为流动相B相，按下列梯度洗脱：0～4分钟，A：3%；4～4.2分钟，A：3%→40%；4.2～9分钟，A：40%；9～9.5分钟，A：40%→3%；9.5～15分钟，A：3%。电喷雾离子源（ESI）负离子模式下选择质荷比（m/z）153.1→80.9作为定量离子对，153.1→109.0作为定性离子对进行检测。
      同时测定黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、B2及T-2毒素时，可以乙腈-甲醇（1：1）为流动相A，以0.01%甲酸溶液为流动相B，按下列梯度洗脱：0～2分钟，A：5%；2～2.01分钟，A：5%→40%；2.01～5分钟，A：40%→50%；5～7分钟，A：50%→55%；7～10分钟，A：55%→90%；10～10.01分钟，90%→5%；10.01～13分钟，A：5%。采用三重四极杆串联质谱仪作为检测器，电喷雾离子源（ESI），黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1、伏马毒素B1、B2及T-2毒素为正离子采集模式，赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮为负离子采集模式，化合物质谱参数见下表。
    
      2.对照品溶液的制备
      可参考高效液相色谱法项下对照品溶液的制备方法配制成不同浓度的系列工作溶液。同时测定黄曲霉毒素G2、G1、B2、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、B2及T-2毒素时，可用50%乙腈水溶液进行配制。
      测定时可根据样品实际情况，采用空白基质溶液（即不含待测真菌毒素的同种样品按供试品溶液制备方法制得的溶液）进行配制。
      3.供试品溶液的制备
      可参考高效液相色谱法项下，适当稀释至合适浓度，作为供试品溶液。同时测定黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、B2及T-2毒素时，可将样品用70%甲醇溶液超声提取，提取液经HLB柱净化。
      4.内标的选择
      由于中药基质复杂，不同基质样品提取效率各不相同。必要时可选择同位素内标对基质效应进行校正。同时应对内标物的浓度进行考察。
      5.样品测定及结果判断
      供试品色谱中如检出与对照品保留时间相同的色谱峰，并且所选择的多对子离子的质荷比一致，供试品溶液的定性离子相对丰度比与浓度相当的对照品溶液的定性离子相对丰度比进行比较时，相对偏差不超过下列规定的范围，则可判定样品中存在该组分：相对比例>50%，允许±20%偏差；相对比例20%～50%，允许±25%偏差；相对比例10%～20%，允许±30%偏差；相对比例<10%，允许士50%偏差。
      一般应采用标准曲线法测定样品中各真菌毒素的含量。
      6.注意事项
      色谱-质谱联用方法作为定性确证方法，可采用多种不同原理的质谱作为检测技术，但均应保证结果的准确可靠。
      应注意真菌毒素适宜的进样浓度，避免交叉污染或对系统造成残留污染，注意采用空白试剂、空白基质、标准物质等进行过程质量控制。