3405 肽图检查法

3405 肽图检查法
    本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性。
    第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法
    照高效液相色谱法（通则0512）测定。
    色谱条件 以蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为30℃±5℃，对照品与供试品保存温度为2～8℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，流速为每分钟1ml，梯度洗脱70分钟（A液从100%～30%，B液从0～70%），检测波长为214nm。
    检查法 取供试品溶液及对照品溶液（均为每1ml中含1mg的溶液，如供试品和对照品浓度不够，则应浓缩至相应的浓度），分别用1%碳酸氢铵溶液充分透析，按1：50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的（或序列分析纯）胰蛋白酶适量，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每1ml中含0.1mg的溶液]到供试品溶液与对照品溶液中，于37℃保温16～24小时后，按1：10加入50% 醋酸溶液，以每分钟10000转离心5分钟（或用0.45μm滤膜滤过），精密量取上清液100μl，分别注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图。将供试品溶液的图谱与对照品溶液的图谱进行比较，即得。
    第二法 溴化氰裂解法
    检查法 取供试品与对照品适量（约相当于蛋白质50μg），用水透析16小时，冷冻干燥，加溴化氰裂解液[称取溴化氰0.3g，加甲酸（70→100）1ml使溶解]20μl溶解，室温放置24小时，裂解物加水180μl，再冷冻干燥。冻干的裂解物用水复溶至适当浓度。照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（通则0541第五法）（胶浓度20%）进行电泳，用银染法染色。
    将供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。