3125 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法

3125 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法
    本法系依据磷酸组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物，以此测定组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺含量。
    磷酸组胺对照品溶液的制备 取磷酸组胺对照品7mg，精密称定，置25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为磷酸组胺贮备液，-20℃贮存备用。试验当天准确量取磷酸组胺贮备液0.1ml，置100ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，即为磷酸组胺对照品溶液。
    供试品溶液的制备 量取供试品0.5ml，加水1.2ml，混匀，加25%三氯乙酸溶液0.3ml，混匀，以每分钟4000转离心10分钟，取上清液，即为供试品溶液。
    测定法 量取供试品溶液1.6ml置试管中，加氯化钠1.5g，再加正丁醇4.0ml、2.5mol/L氢氧化钠溶液0.2ml，立即混匀5分钟，静置后，取出正丁醇相3.6ml加到已装有0.1mol/L盐酸溶液1.2ml和正庚烷2.0ml的试管内，振荡5分钟，弃有机相，量取盐酸相1.0ml，加入等体积水，再加0.4mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混匀并迅速加入0.1%邻苯二甲醛-甲醇溶液0.1ml，立即混匀，置 21～22℃10分钟，加0.5mol/L盐酸溶液0.5ml终止反应，取终止反应后的溶液200μl，加入酶标板孔中，用荧光酶标仪，在激发波长350nm和发射波长450nm处测荧光强度。
    准确量取磷酸组胺对照品溶液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml、0.025ml，分别置试管中，各以0.1mol/L盐酸溶液补足至1.0ml；向各管中加水0.5ml、25%三氯乙酸溶液0.1ml，混匀，加氯化钠1.5g，自“再加正丁醇4.0ml”起，同法操作。
    以磷酸组胺对照品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程，求出供试品溶液碱基含量（G），按下式计算：
    供试品游离磷酸组胺含量（ng/ml）=G×2.76×2.5
    【附注】磷酸组胺分子量为307.148，对照品溶液浓度按碱基计，碱基与磷酸组胺分子量比为1：2.76。式中2.5为供试品稀释倍数。