本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％。
第一法 管碟法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液 取枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液 取短小芽孢杆菌（CMCC（B）63 202〕的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或〔ATCC29 213〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌〔CMCC（B）28 001〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液 取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液 取啤酒酵母菌〔ATCC 9763〕的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于IV号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。
肺炎克雷伯菌（Klebosiella pneumoniae）悬液 取肺炎克雷伯菌〔CMCC（B）46 117〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。
支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）悬液 取支气管炎博德特菌〔CMCC（B）58 403〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32～35℃培养24小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。
标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。
双碟的制备 取直径约90mm，高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（表l）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃）加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径为6.0mm±0.1mm，高为10.0mm±0.1mm，外径为7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。
检定法
二剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径（或面积），照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法进行可靠性测验及效价计算。
三剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度（S3）、中浓度（S2）及低浓度（S1）的标准品溶液，其余3个小管中分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为1：0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径（或面积），照生物检定统计法（通则1431）中的（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
第二法 浊度法
本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液制备
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠埃希蔺（Escherichia coli）悬液 取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
白色念珠菌（Candida albicans）悬液 取白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕的改良马丁琼腊斜面的新鲜培养物，接种于10ml培养基IX中，置35～37℃培养8小时，再用培养基IX稀释至适宜浓度，备用。
标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表3的规定进行稀释。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，照各品种项下规定进行供试品溶液的配制。
含试验菌液体培养基的制备 临用前，取规定的试验菌悬液适量（35～37℃培养3～4小时后测定的吸光度在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。
已接种试验菌的液体培养基应立即使用。
检定法
标准曲线法 除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各品种项下规定的剂量-反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1：1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1→3）0.5ml以终止微生物生长，在530mn或580mn波长处测定各管的吸光度。同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。
抗生素微生物检定法标准曲线法的计算及统计学检验
标准曲线法的计算及可靠性检验
1.标准曲线的计算
将标准品的各浓度lg值及相对应的吸光度列成表4。
2.回归系数的显著性测验
判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。
假设H0：b=0，在假设H0成立的条件下，按公式（4）～（6）计算t值。
式中：yi为标准品的实际吸光度；
Y为估计吸光度〔由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到〕；
y（平均）为标准品实际吸光度的均值；
xi为抗生素标准品实际浓度lg值；
x（平均）为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。
对于相应自由度（2n—4）给定的显著性水平α（通常α=0.05），査表得tα/2（n-2），若|t|>tα/2（n-2），则拒绝H0，认为回归效果显著，即X、Y具有直线回归关系；若|t|≤tα/2（n-2），则接受H0，认为回归效果不显著，即X、Y不具有直线回归关系。
3.测定结果的计算及可信限率估计
3.1 抗生素浓度lg值的计算 当回归系数具有显著意义时，测得供试品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程（3），按方程（7）计算抗生素的浓度lg值。
抗生素的浓度lg值：X0＝（Y0-a）/b （7）
3.2 抗生素浓度（或数学转换值）可信限的计算 按公式（4）和（8）计算得到的抗生素浓度lg值在95％置信水平（α=0.05）的可信限。
X0的可信限：
3.3 可信限率的计算 按公式（9）计算得到的抗生素浓度（或数学转换值）的可信限率。
3.4 供试品含量的计算 将计算得到的抗生素浓度（将lg值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。
二剂量法或三剂量法 除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择适宜的高、（中、）低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，二剂量的剂距为2：1或4：1，三剂量的剂距为1：0.8。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法和（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
培养基及其制备方法
培养基I
胨 5g 琼脂 15～20g
牛肉浸出粉 3g 水 1000ml
磷酸氢二钾 3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ
胨 6g 葡萄糖 1g
牛肉浸出粉 1.5g 琼脂 15～20g
酵母浸出粉 6g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ
胨 5g 磷酸氢二钾 3.68g
牛肉浸出粉 1.5g 磷酸二氢钾 1.32g
酵母浸出粉 3g 葡萄糖 1g
氯化钠 3.5g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ
胨 10g 葡萄糖 10g
氯化钠 10g 琼脂 20～30g
枸橼酸钠 10g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基V
胨 10g 琼脂 20～30g
麦芽糖 40g 水 1000ml
除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅵ
胨 8g 酵母浸出粉 5g
牛肉浸出粉 3g 磷酸二氢钾 1g
氯化钠 45g 琼脂 15～20g
磷酸氢二钾 3.3g 水 1000ml
葡萄糖 2.5g
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅶ
胨 5g 枸橼酸钠 10g
牛肉浸出粉 3g 琼脂 15～20g
磷酸氢二钾 7g 水 1000ml
磷酸二氢钾 3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅷ
酵母浸出粉 1g 琼脂 15～20g
硫酸铵 1g 磷酸盐缓冲液（pH6.0）1000ml
葡萄糖 5g
混合上述成分，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅸ
蛋白胨 7.5g 氯化钠 5.0g
酵母膏 2.0g 葡萄糖 10.0g
牛肉浸出粉 1.0g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.5，在115℃灭菌30分钟。
营养肉汤培养基
胨 10g 肉浸液① 1000ml
氯化钠 5g
①肉浸液也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代替 。
取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，在115℃灭菌30分钟。
营养琼脂培养基
胨 10g 琼脂 15～20g
氯化钠 5g 肉浸液① 1000ml
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
改良马丁培养基
胨 5.0g 酵母浸出粉 2.0g
硫酸镁 0.5g 琼脂 15～20g
磷酸氢二钾 1.0g 水 1000ml
葡萄糖 20.0g
除葡萄糖外，混合上述成分，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
多黏菌素B用培养基
蛋白胨 6.0g 酵母浸膏 3.0g
牛肉浸膏 1.5g 琼脂 15～20g
胰消化酪素 4.0g 水 1000ml
葡萄糖 1.0g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.7，在115℃灭菌30分钟。
培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
灭菌缓冲液
磷酸盐缓冲液（pH5.6） 取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钠溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
