3303 鼠源性病毒检查法

3303 鼠源性病毒检查法
    鼠源性单克隆抗体制品具有潜在病毒污染，如出血热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、Ⅲ型呼肠孤病毒、仙台病毒、脱脚病病毒、小鼠腺病毒、小鼠肺炎病毒、逆转录病毒等。其中，前4种病毒属Ⅰ组，为能够感染人与灵长类动物的病毒；后4种属Ⅱ组，为目前尚无迹象表明感染人的病毒，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类具有潜在危险性，这些病毒应作为重点进行检测。
    本法用于杂交瘤细胞株及鼠源性单克隆抗体制品的鼠源性病毒检测。通过细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等检测活病毒抗原及病毒抗体。
    试剂  （1）0.01mol/L pH7.4 PBS  称取磷酸氢二钠（Na2HP04*12H2O）2.9g、磷酸二氢钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml。
    （2）pH9.6包被缓冲液  称取碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、叠氮钠0.20g，加水溶解并稀释至1000ml。
    （3）0.0mol/L pH7.4 PBS洗液  称取磷酸氢二钠（Na2HP04*12H2O）2.9g、磷酸二氢钠0.295g、氯化钠8.5g、聚山梨酯80 5ml，加水溶解并稀释至1000ml。
    （4）底物缓冲液  称取磷酸氢二钠（Na2HP04*12H20）12.9g、枸橼酸3.26g，加水溶解并稀释至700ml。
    （5）底物溶液  称取邻苯二胺4mg，溶于底物缓冲液10ml中，再加入30%过氧化氢4μl。
    （6）终止液  1mol/L硫酸溶液。
    供试品的制备  供试品包括杂交瘤细胞株、腹水和单克隆抗体半成品或成品。杂交瘤细胞株应进行细胞试验、动物抗体产生试验和鸡胚感染试验；腹水和单克隆抗体半成品或成品应进行动物抗体产生试验和鸡胚感染试验。
    （1）细胞试验用的供试品  取3瓶生长良好的杂交瘤细胞，于-40℃反复冻融3次后，在无菌条件下合并分装小管，每管3ml，换上胶塞，-40℃保存。
    （2）动物抗体产生试验用的供试品  单克隆抗体腹水、半成品或成品，不需处理，-20℃保存。而杂交瘤细胞按下述步骤进行处理后使用。
    取7瓶生长良好的杂交瘤细胞，弃去培养液，用PBS轻轻将细胞吹打下来，移入小管，再用PBS冲洗细胞瓶，以收集残余的细胞。于小管中洗涤，以每分钟1000转离心10分钟，弃去上清液，用PBS重新悬浮细胞，以上步骤重复2次。细胞集中后，悬浮于4ml PBS 中，冻融3次，超声处理。以每分钟10 000转离心30分钟，吸取上清液，以每分钟40 000转离心4小时，弃上清液，将沉淀溶于适量的PBS中，即为动物抗体产生试验用抗原。-40℃保存。
    检查法  检查方法包括细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等。
    1.细胞试验
    用已知病毒抗体检查供试品中未知病毒抗原。
    （1）细胞培养  根据被检的病毒，选择其敏感的细胞。每种细胞6瓶，细胞应生长良好。用0.01mol/LpH7.4 PBS洗细胞2次。每瓶接种供试品0.3ml，每批供试品接种4瓶，另外2瓶为对照。37℃吸附1小时，弃去吸附的供试品液体，加入细胞维持液。每天观察细胞形态，并记录结果。接种后每隔3～4天换1次液。第1代细胞应维持10～14天。冻融3次后，将对照组2瓶、供试品组4瓶分别合并。将收获的对照组和供试品组的细胞悬液分别接种同种细胞，接种后，每隔3～4天，换1次液.
    （2）涂片  培养至10～14天，吸出维持液，再用PBS洗细胞2次，每瓶加消化液0.15ml，使细胞分散、脱壁，吸出细胞悬液，再用PBS洗涤2次。用适量的PBS悬浮细胞，将对照组的正常细胞涂在抗原片的第1行，供试品组的细胞涂在第2行，吹干，丙酮固定，-40℃保存，即为供试品细胞涂片。
    （3）间接免疫荧光法检测  制备已知病毒抗原片，将已知特异性阳性血清和阴性血清进行1：5～1：20的稀释；应用制备的已知病毒抗原片作为血清对照，检查供试品细胞涂片。将涂有供试品细胞的玻片，加经PBS 10倍稀释的已知阳性血清、阴性血清，置湿盒中，37℃放置30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡5分钟，待干燥后，滴加荧光抗体，37℃保温30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡5分钟，再用水洗1次，待干燥后，加50%甘油，用盖玻片封好，镜检。
    （4）结果判定  在已知病毒抗原片上，阴性对照血清与正常细胞孔、病毒细胞孔无荧光，阳性对照血清与正常细胞孔无荧光，与病毒细胞孔有荧光；在供试品细胞涂片上，阴性对照血清与正常细胞孔、供试品细胞孔无荧光，阳性对照血清与正常细胞孔无荧光时，试验成立。阴性对照血清与正常细胞孔和供试品细胞孔有荧光反应或阳性对照血清与正常细胞孔有荧光反应，试验不成立。供试品细胞涂片上，阳性对照血清与供试品细胞孔有荧光，判为阳性。
    2.动物抗体产生试验
    （1）供试品抗体的制备  每批供试品按下表参数注射无特定病原体小鼠（BALB/c或KM）共50只。
    
    （2）血清学检查  对经肌内注射和腹腔注射的供试品组和对照组小鼠分别采血，分离血清后用ELISA法检测抗体。包被病毒抗原和正常细胞抗原，每孔0.1ml，置37℃、1小时后，放4℃过夜，用洗液充分洗涤，拍干。每份供试品分别加入病毒抗原孔和正常细胞抗原孔各1个，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。加酶结合物，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。每孔加入底物溶液0.1ml， 37℃培养10～20分钟，当阳性血清对照孔出现颜色，阴性对照孔无颜色时，每孔加入1mol/L硫酸溶液0.1ml终止反应，测吸光度。
    （3）结果判定  P/N值不小于2.1为阳性；
    P/N值在1.5～2.0为可疑；
    P/N值小于1.5为阴性。
    P为供试品免疫小鼠血清与病毒抗原的吸光度减去供试品免疫小鼠血清与正常细胞抗原的吸光度；
    N为对照组动物血清与病毒抗原的吸光度减去对照组动物血清与正常细胞抗原的吸光度。
    3.鸡胚感染试验
    于接种前24小时观察鸡胚。活鸡胚具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可看到胚动。死胚血管暗昏模糊，没有胚动。接种前用检卵灯再次检查鸡胚活力，并标出气室和胚胎的位置。按无菌操作要求，以卵黄囊、尿囊腔和绒毛尿囊膜途径接种供试品。接种后，每日观察，培养5天。无菌操作收集卵黄囊、绒毛尿囊膜和尿囊液。卵黄囊和绒毛尿囊膜经研磨后，离心，取上清液，与尿囊液分别用豚鼠或鸡红细胞做血凝试验。
    取每排8孔微量血凝反应板，从第2孔至第8孔每孔加生理氯化钠溶液50μl。第1、2孔各加经上述处理的供试品50μl，然后从第2孔吸取50μl至第3孔，第3孔吸取50μl至第4孔（以此类推）进行倍比稀释，至第7孔时丢弃50μl。第8孔为对照孔。第1孔至第8孔各加1%豚鼠红细胞悬液50μl，混匀。做2块反应板，分别静置于4℃和室温，至对照孔呈现明显阴性时判定结果。
    结果判定：
    ++++  红细胞均匀铺于孔底；
    +++  红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐，有下滑趋向；
    ++  红细胞于孔底形成小环，但周围有小凝集块；
    +  红细胞于孔底形成小团，边缘可见少许凝集块；
    -  红细胞集中在孔底中央，呈一边缘致密的红点。
    以凝集反应出现“++”，或“++” 以上者判为阳性。