3102 唾液酸测定法

3102 唾液酸测定法
    （间苯二酚显色法）
    本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。
    唾液酸对照品溶液（200μg/ml）的制备 精密称取唾液酸对照品10.52mg（1μg相当于3.24mol），置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液（1mg/ml），按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年。仅可冻融1次。4℃保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml，置5ml量瓶中，加水至刻度，即为每1ml含200μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。
    用于C群脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗唾液酸含量测定时，同法制备浓度为400μg/ml的唾液酸对照品溶液贮备液（精密称取唾液酸40mg，置100ml量瓶中，用纯化水溶解并定容至刻度，混匀，即得）。精密量取唾液酸贮备液2.0ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，即为每1ml含唾液酸80μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。
    测定法 取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度为每1ml含0.2～0.4mg，作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中，混匀，每管再加入间苯二酚-盐酸溶液（分别量取2%间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μl、25%盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混匀。试验前4小时内配制）1ml，加盖，沸水煮沸30分钟（水浴面高于液面约2cm），取出置冰浴中3分钟（同时振摇）后，每管加乙酸丁酯-丁醇溶液（取4体积乙酸丁酯与1体积丁醇混匀，室温下保存，12小时内使用）2ml，充分混匀，室温放置10分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长580nm处测定吸光度。
    	
    脑膜炎球菌疫苗唾液酸含量测定：取含唾液酸约40μg/ml的供试品溶液和纯水对照各2ml，另分别取唾液酸对照品（80μg/ml）0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml于各管中，补水至2.0ml为标准曲线各点。各管加2ml显色剂（0.1mol/L硫酸铜溶液0.5ml、4%间苯二酚溶液5ml，浓盐酸80ml，补水至100ml混匀。临用现配）摇匀，沸水浴15分钟后冰浴5～10分钟，每管加4ml有机相（正丁醇15ml，加乙酸丁酯定容至100ml），充分摇匀后置室温10分钟。以纯水对照为0点，于585nm测定吸光度，并作直线回归。（可按比例缩小供试品及各试剂体积）
    以唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归（相关系数应不低于0.99），由直线回归方程计算5μg唾液酸的吸光度值，再按下式计算供试品唾液酸含量。
    
    式中 A1为5μg唾液酸的吸光度；
    A2为供试品的吸光度；
    n为供试品稀释倍数；
    P为供试品蛋白质含量，μg/μl；
    W为1nmol促红素的量（不包括糖成分量），相当于30.6μg。
    脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗供试品唾液酸含量（μg/ml）=A×n
    式中 A为供试品溶液吸光度相对于唾液酸对照品溶液的浓度，μg/ml；
    n为供试品的稀释倍数。