重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）

重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Hanxun Jiaomu)Recombinant Hepatitis B Vaccine (Hansenula polymorpha)
    本品系由重组汉逊酵母表达的乙型肝炎（简称乙肝） 病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入铝佐剂制成。用于预防乙型肝炎。
    1 基本要求
    生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2 制造
    2.1 生产用菌种
    2.1.1 名称及来源
    以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组汉逊酵母工程菌株。菌种号为HBsAgU35-16-9或其他批准的重组汉逊酵母工程菌株。
    2.1.2 种子批的建立
    应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
    原始种子HBsAgU35-16-9在酵母完全培养基上连续扩增2代为主种子批，主种子批连续扩增2代为工作种子批。
    2.1.3 种子批菌种的检定
    主种子批及工作种子批应进行以下全面检定。
    2.1.3.1 HBsAg基因序列测定
    HBsAg基因序列应与原始种子批保持一致。
    2.1.3.2 HBsAg外源基因和酵母MOX基因的检定 
    扩增得2条PCR产物的DNA电泳条带长度应为：HBsAg外源基因DNA 761bP；酵母MOX基因 DNA 2072bp。
    2.1.3.3 外源基因整合于宿主染色体中的检定 
    种子批菌种基因组DNA应无游离质粒DNA电泳条带；扩增的PCR产物中应有HBsAg外源基因DNA电泳条带。
    2.1.3.4 HBsAg外源基因拷贝数检定 
    种子批菌种采用杂交法检测，整合HBsAg外源基因拷贝数应在30个以上。
    2.1.3.5 整合基因稳定性试验 
    种子批菌种培养160小时，应符合2.1.3.4项要求。
    2.1.3.6 培养物纯度
    将菌种接种至酵母完全培养基中，于33℃培养14～18小时后，将培养物分别接种于胰酪胨大豆肉汤培养基与液体硫乙醇酸盐培养基，于30～35℃培养7天，应无细菌和其他真菌检出。
    2.1.4 菌种保存
    种子批应于液氮中保存，工作种子批于-70℃保存时应不超过6个月。
    2.2 原液 
    2.2.1 发酵
    取工作种子批菌种，于适宜温度和时间，经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获汉逊酵母。
    2.2.2 培养物的检定
    2.2.2.1 HBsAg外源基因拷贝数检定
    按2.1.3.4项进行。
    2.2.2.2 培养物纯度
    将培养物分别接种于胰酪胨大豆肉汤培养基与液体硫乙醇酸盐培养基，于30～35℃培养7天，应无细菌和其他真菌检出。
    2.2.3 纯化
    采用适宜的方法破碎汉逊酵母，离心除去细胞碎片，用硅胶吸附，柱色谱法和溴化钾密度梯度离心法或其他适宜方法纯化HBsAg后，进行除菌过滤，即为原液。
    2.2.4 原液检定 
    按3.1项进行。
    2.2.5 原液保存 
    于2～8℃保存应不超过3个月。
    2.3 半成品 
    2.3.1 甲醛处理
    原液中按终浓度为100μg/ml加入甲醛，于37℃保温适宜时间。
    2.3.2 铝吸附
    将蛋白质和铝剂以一定比例混合，置适宜温度下吸附一定时间，经洗涤后即为铝吸附产物。
    2.3.3 配制
    用无菌生理氯化钠溶液按最终蛋白质含量为20μg/ml 稀释铝吸附产物，即为半成品。
    2.3.4 半成品检定 
    按3. 2项进行。
    2.4 成品 
    2.4.1 分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2 分装
    应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
    2.4.3 规格
    每瓶0.5ml。每1次人用剂量0.5ml，含HBsAg 10μg。 
    2.4.4 包装
    应符合“生物制品包装规程”规定。
    3 检定 
    3.1 原液检定 
    3.1.1 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.1.2 蛋白质含量
    应为100～300μg/ml（通则0731第二法）。
    3.1.3 特异蛋白带
    采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（通则0541第五法），分离胶胶浓度15%，上样量为0.5μg，银染法染色。应有分子质量为20～25kD的蛋白带；可有多聚体蛋白带。
    3.1.4 纯度
    采用分子排阻色谱法（通则0514），亲水甲基丙烯酸树脂体积排阻色谱柱；排阻极限10 000kD；孔径100nm；粒度17μm；流动相为含0.05%叠氮钠的1mmol/L PBS（pH7.0）；上样量10μl；检测波长280nm，按面积归一化法计算，HBsAg含量应不低于99.0%。
    3.1.5 细菌内毒素检查
    应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
    3.1.6 宿主细胞DNA残留量 
    应不高于10ng/剂（通则3407）。
    3.1.7 宿主细胞蛋白质残留量
    应不超过总蛋白质含量的1.0% （通则3414）。
    3.1.8 N端氨基酸序列测定（每年至少测定1次） 
    用氨基酸序列分析仪测定，N端氨基酸序列应为：（Met）-Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu。
    3.1.9 聚山梨酯20残留量 
    应不高于10μg/20μg蛋白质（通则3203）。
    3.2 半成品检定 
    3.2.1 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.2.2 pH 值
    应为5.5～7.0 （通则0631）。
    3.2.3 铝含量
    应为 0.45～0.60mg/ml（通则 3106）。
    3.2.4 细菌内毒素检查
    应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
    3.2.5 吸附完全性试验
    将供试品于6500g离心5分钟取上清液，依法测定（通则3501）参考品、供试品及其上清液中HBsAg含量。以参考品HBsAg含量的对数对其相应吸光度对数作直线回归，相关系数应不低于0.99，将供试品及其上清液的吸光度值代入直线回归方程，计算其HBsAg含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。
    P（%） = （1-cs/ct）*100
    式中 P为吸附率，
           cs为供试品上清液的HBsAg含量，μg/ml；
           ct为供试品的HBsAg含量，μg/ml。 
    3.2.6 渗透压摩尔浓度
    应为280mOsmol/kg±65mOsmol/kg （通则 0632）。
    3.3 成品检定 
    3.3.1 鉴别试验
    采用酶联免疫法检查，应证明含有HBsAg。
    3.3.2 外观
    应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。
    3.3.3 装量
    依法检查（通则0102），应不低于标示量。
    3.3.4 渗透压摩尔浓度 
    依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
    3.3.5 化学检定
    3.3.5.1 pH 值
    应为5.5～7.0 （通则0631）。
    3.3.5.2 铝含量
    应为 0.45～0.60mg/ml （通则3106）。
    3.3.5.3 游离甲醛含量 
    应不高于15μg/ml（通则3207第二法）。
    3.3.5.4 聚乙二醇6000残留量 
    应小于200μg/ml （通则3202）。
    3.3.6 体外相对效力测定 
    应不低于1.0（通则3501）。
    3.3.7 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3.8 异常毒性检查 
    依法检查（通则1141），应符合规定。
    3.3.9 细菌内毒素检查
    应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
    4 保存、运输及有效期
    于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为36个月。
    5 使用说明
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
    重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）说明书
    【药品名称】
    通用名称：重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）
    英文名称：Recombinant Hepatitis B Vaccine （Hansenula polymorpha）
    汉语拼音：Chongzu Yixing Ganyan Yimiao （Hanxun Jiaomu）
    【成分和性状】  本品系由重组汉逊酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入铝佐剂制成。为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散。
    有效成分：乙型肝炎病毒表面抗原。
    辅料：应列出全部批准的辅料成分。
    【接种对象】  本疫苗适用于乙型肝炎易感者，尤其是下列人员：
    （1） 新生儿，特别是母亲为HBsAg、HBeAg阳性者。
    （2） 从事医疗工作的医护人员及接触血液的实验人员。
    【作用与用途】  接种本疫苗后，可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力。用于预防乙型肝炎。
    【规格】 每瓶0.5ml。每1次人用剂量0.5ml，含 HBsAg 10μg。
    【免疫程序和剂量】  （1） 于上臂三角肌肌内注射。
    （2） 免疫程序为3针，分别在0、1、6月接种，新生儿在出生后24小时内注射第1针，每次注射1剂疫苗。
    【不良反应】
    常见不良反应：
    接种后24小时内，在注射部位可能感到疼痛和触痛，多数情况下于2～3天内自行消失。
    罕见不良反应：
    （1） 接种者在接种疫苗后72小时内，可能出现一过性发热反应，一般持续1～2天后可自行缓解。
    （2） 接种部位轻、中度的红肿、疼痛，一般持续1～2天后可自行缓解，不需处理。
    极罕见不良反应：
    （1） 接种部位可出现硬结，一般1～2个月可自行吸收。
    （2） 局部无菌性化脓：一般要用注射器反复抽出脓液，严重时（破溃）需扩创清除坏死组织，病时较长，最后可吸收愈合。
    （3） 过敏反应：过敏性皮疹、阿瑟反应。阿瑟反应一般出现在接种后10天左右，局部红肿持续时间长，可用固醇类药物进行全身和局部治疗。
    （4） 过敏性休克：一般在注射疫苗后1小时内发生，应及时注射肾上腺素等抢救措施进行治疗。
    【禁忌】  （1） 已知对该疫苗的任何成分，包括辅料以及甲醛过敏者。
    （2） 患急性疾病、严重慢性疾病、慢性疾病的急性发作期和发热者。
    （3） 妊娠期妇女。
    （4） 对未控制的癫痫和其他进行性神经系统疾病者。 
    【注意事项】  （1） 以下情况者慎用：家族和个人有惊厥史者、患慢性疾病者、有癫痫史者、过敏体质者。
    （2） 使用时应充分摇匀，如出现摇不散的凝块、异物、疫苗瓶有裂纹或标签不清者，均不得使用。
    （3） 疫苗瓶开启后应立即使用。
    （4） 应备有肾上腺素等药物，以备偶有发生严重过敏反应时急救用。接受注射者在注射后应在现场观察至少30分钟。
    （5） 注射第1针后出现高热、惊厥等异常情况者，一般不再注射第2针，对于母婴阻断的婴儿，如注射第2、3针应遵照医嘱。
    （6） 严禁冻结
    【贮藏】  于2～8℃避光保存和运输。
    【包装】  按批准的执行。
    【有效期】  36个月。
    【执行标准】
    【批准文号】
    【生产企业】
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