重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）

重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Niangjiu Jiaomu)Recombinant Hepatitis B Vaccine(Saccharomyces cerevisiae)
    本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎（简称乙肝） 病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入铝佐剂制成。用于预防乙型肝炎。
    1 基本要求
    生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2 制造
    2.1 生产用菌种
    2.1.1 名称及来源
    生产用菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿洒酵母原始菌种，菌种号为2150-2-3 （pHBS56-GAP347/33）。
    2.1.2 种子批的建立
    应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
    由美国默克公司提供的菌种经扩增1代为主种子批，主种子批扩增1代为工作种子批。
    2.1.3 种子批菌种的检定
    主种子批及工作种子批应进行以下全面检定。
    2.1.3.1 培养物纯度
    培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板，分别于20～25℃和30～35℃培养5～7天，应无细菌和其他真菌被检出。
    2.1.3.2 HBsAg基因序列测定
    HBsAg基因序列应与原始菌种2150-2-3保持一致。
    2.1.3.3 质粒保有率
    采用平板复制法检测。将菌种接种到复合培养基上培养，得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养，计算质粒保有率，应不低于95%。
    PR （%） =A/（A+L）*100
    式中 PR为质粒保有率，%；
           A为在含腺嘌呤的基本培养基上生长的菌落数， CFU/皿；
           A+L为在含腺嘌呤和亮氨酸的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿。
    2.1.3.4 活菌率
    采用血细胞计数板，分别计算每1ml培养物中总菌数和活菌数，活菌率应不低于50%。
    活菌率（%） =活菌数/总菌数*100
    2.1.3.5 抗原表达率
    取种子批菌种扩增培养，采用适宜的方法将培养后的细胞破碎，测定破碎液的蛋白质含量（通则0731第二法），并采用酶联免疫法或其他适宜方法测定HBsAg含量。抗原表达率应不低于0.5%。
    抗原表达率（%）=抗原含量/蛋白质含量*100
    2.1.4 菌种保存
    主种子批和工作种子批菌种应于液氮中保存，工作种子批菌种于-70℃保存应不超过6个月。
    2.2 原液 
    2.2.1 发酵
    取工作种子批菌种，于适宜温度和时间经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获的酵母菌应冷冻保存。 
    2.2.2 培养物检定
    2.2.2.1 培养物纯度 
    按2.1.3.1项进行。
    2.2.2.2 质粒保有率 
    按2.1.3.3项进行，应不低于90%。
    2.2.3 培养物保存 
    于-60℃以下保存不超过6个月。
    2.2.4 纯化
    用细胞破碎器破碎酿酒酵母，除去细胞碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，经稀释和除菌过滤后即为原液。
    2.2.5 原液检定 
    按3.1项进行。
    2.2.6 原液保存 
    于2～8℃保存不超过3个月。
    2.3 半成品 
    2.3.1 甲醛处理
    原液中按终浓度为100μg/ml加入甲醛，于37℃保温适宜时间。
    2.3.2 铝吸附
    每1μg蛋白质和铝剂按一定比例置2～8℃吸附适宜的时间，用无菌生理氯化钠溶液洗涤，去上清液后再恢复至原体积，即为铝吸附产物。
    2.3.3 配制
    蛋白质浓度为20.0～27.0μg/ml的铝吸附产物可与铝佐剂等量混合后，即为半成品。
    2.3.4 半成品检定 
    按3. 2项进行。
    2.4 成品 
    2.4.1 分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2 分装
    应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
    2.4.3 规格
    每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含HBsAg 10μg；或每1次人用剂量1.0ml，含HBsAg 20μg。
    2.4.4 包装
    应符合“生物制品包装规程”规定。
    3 检定 
    3.1 原液检定
    3.1.1 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.1.2 蛋白质含量
    应为20.0～27.0μg/ml （通则0731第二法）。
    3.1.3 特异蛋白带
    采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（通则0541第五法），分离胶胶浓度为15%，上样量为1.0μg，银染法染色。应有分子质量为20～25kD蛋白带，可有HBsAg多聚体蛋白带。
    3.1.4 N端氨基酸序列测定（每年至少测定1次） 
    用氨基酸序列分析仪测定，N端氨基酸序列应为：Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu。
    3.1.5 纯度
    采用免疫印迹法测定（通则3401），所测供试品中酵母杂蛋白应符合批准的要求；采用高效液相色谱法（通则0512），亲水硅胶高效体积排阻色谱柱；排阻极限1000kD；孔径45nm，粒度13μm，流动相为含0.05%叠氮钠和0.1%SDS的磷酸盐缓冲液（pH7.0）；上样量100μl，检测波长280nm。按面积归一法计算P60蛋白质含量，杂蛋白应不高于1.0%。
    3.1.6 细菌内毒素检查
    应小于10EU/ml （通则1143凝胶限度试验）。
    3.1.7 宿主细胞DNA残留量 
    应不高于10ng/剂（通则3407）。
    3.2 半成品检定 
    3.2.1 吸附完全性
    将供试品于6500g离心5分钟取上清液，依法测定（通则3501）参考品、供试品及其上清液中HBsAg含量，以参考品HBsAg含量的对数对其相应吸光度对数作直线回归，相关系数应不低于0.99，将供试品及其上清液的吸光度值代人直线回归方程，计算其HBsAg含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。
    P （%） =（1-cs/ct）*100
    式中 P为吸附率
           cs为供试品上清液的HBsAg含量，μg/ml；
           ct为供试品的HBsAg含量，μg/ml。
    3.2.2 化学检定
    3.2.2.1 硫氰酸盐含量
    将供试品于6500g离心5分钟，取上清液。分别取含量为 1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml的硫氰酸盐标准溶液、供试品上清液、生理氯化钠溶液各5.0ml于试管中，每一供试品取2份，在每管中依次加入硼酸盐缓冲液（pH9.2）0.5ml，2.25%氯胺T-0.9%氯化钠溶液0.5ml，50%吡啶溶液（用生理氯化钠溶液配制）1.0ml，每加一种溶液后立即混匀，加完上述溶液后静置10分钟，以生理氯化钠溶液为空白对照，在波长415nm处测定各管吸光度。以标准溶液中硫氰酸盐的含量对其吸光度均值作直线回归，计算相关系数，应不低于0.99，将供试品上清液的吸光度均值代入直线回归方程，计算硫氰酸盐含量，应小于1.0μg/ml。
    3.2.2.2 Triton X-100 含量
    将供试品于6500g离心5分钟，取上清液。分别取含量为 5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的Triton X-100标准溶液、供试品上清液、生理氯化钠溶液各2.0ml于试管中，每一供试品取2份，每管分别加入5% （ml/ml）苯酚溶液1.0ml，迅速振荡，室温放置15分钟。以生理氯化钠溶液为空白对照，在波长340nm处测定各管吸光度。以标准溶液中Triton X-100的含量对其吸光度均值作直线回归，计算相关系数，应不低于0.99，将供试品上清液的吸光度均值代入直线回归方程，计算Triton X-100含量，应小于 15.0 μg/ml。
    3.2.2.3 pH 值 
    应为5.5～7.2（通则0631）。
    3.2.2.4 游离甲醛含量 
    应不高于20μg/ml（通则3207第二法）。
    3.2.2.5 铝含量
    应为 0.35～0.62mg/ml（通则3106）。
    3.2.2.6 渗透压摩尔浓度
    应为 280mOsmol/kg±65mOsmol/kg（通则0632）。
    3.2.3 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.2.4 细菌内毒素检查
    应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
    3.3 成品检定
    3.3.1 鉴别试验
    采用酶联免疫法检查，应证明含有HBsAg。
    3.3.2 外观
    应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。
    3.3.3 装量
    依法检查（通则0102），应不低于标示量。
    3.3.4 渗透压摩尔浓度 
    依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
    3.3.5 化学检定
    3.3.5.1 pH 值
    应为5.5～7.2（通则0631）。
    3.3.5.2 铝含量
    应为 0.35～0.62mg/ml（通则3106）。
    3.3.6 体外相对效力测定
    应不低于0.5（通则3501）。
    3.3.7 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3.8 异常毒性检查
    依法检查（通则1141），应符合规定。
    3.3.9 细菌内毒素检查
    应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
    4 保存、运输及有效期
    于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为36个月。
    5 使用说明
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
    重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）使用说明
    【药品名称】
    通用名称：重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）
    英文名称：Recombinant Hepatitis B Vaccine （Saccharomyces cerevisciae）
    汉语拼音：Chongzu Yixing Ganyan Yimiao （Niangjiu Jiaomu）
    【成分和性状】  本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入铝佐剂制成。为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散。
    有效成分：乙型肝炎病毒表面抗原。
    辅料：应列出全部批准的辅料成分。
    【接轴对象】  本疫苗适用于乙型肝炎易感者，尤其是下列人员：
    （1） 新生儿，特别是母亲为HBsAg、HBeAg阳性者。
    （2） 从事医疗工作的医护人员及接触血液的实验人员。
    【作用与用途】  接种本疫苗后，可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力。用于预防乙型肝炎。
    【规格】  每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含HBsAg 10μg；或每1次人用剂量1.0ml，含 HBsAg 20μg。
    【免疫程序和剂量】  （1） 于上臂三角肌肌内注射。
    （2） 基础免疫程序为3针，分别在0、1、6月接种。新生儿第1针在出生后24小时内注射。16岁以下人群每1次剂量为10μg，16岁或以上人群每1次剂量为20μg。
    【不良反应】
    常见不良反应：
    —般接种疫苗后24小时内，在注射部位可出现疼痛和触痛，多数情况下于2～3天内自行消失。
    罕见不良反应：
    （1） 一般接种疫苗后72小时内，可能出现一过性发热反应，一般持续1～2天后可自行缓解。
    （2） 接种部位轻、中度的红肿、疼痛，一般持续1～2天后可自行缓解，不需处理。
    （3） 接种部位可出现硬结，一般1～2个月可自行吸收。
    极罕见不良反应：
    （1） 局部无菌性化脓：一般要用注射器反复抽出脓液，严重时（如出现破溃）需扩创清除坏死组织，病时较长，最后可吸收愈合。
    （2） 过敏反应：过敏性皮疹、阿瑟反应。阿瑟反应一般出现在接种后10天左右，局部红肿持续时长，可用固醇类药物进行全身和局部治疗。
    （3） 过敏性休克：一般在接种疫苗后1小时内发生，应及时注射肾上腺素等抢救措施进行治疗。
    【禁忌】  （1） 已知对该疫苗所含任何成分，包括辅料以及甲醛过敏者。
    （2） 患急性疾病、严重慢性疾病、慢性疾病的急性发作期和发热者。
    （3） 妊娠期妇女。
    （4） 患未控制的癫痫和其他进行性神经系统疾病者。 
    【注意事项】  （1） 以下情况者慎用：家族和个人有惊厥史者、患慢性疾病者、有癫痫史者、过敏体质者。
    （2） 使用时应充分摇匀，如疫苗瓶有裂纹、标签不清或失效者、疫苗瓶内有异物者均不得使用。
    （3） 疫苗瓶开启后应立即使用。
    （4） 应备有肾上腺素等药物，以备偶有发生严重过敏反应时急救用。接受注射者在注射后应在现场观察至少30分钟。
    （5） 注射第1针后出现高热、惊厥等异常情况者，一般不再注射第2针。对于母婴阻断的婴儿，如注射第2、3针应遵照医嘱。
    （6） 严禁冻结。
    【贮藏】  于2～8℃避光保存和运输。
    【包装】  按批准的执行。
    【有效期】  36个月。
    【执行标准】
    【批准文号】
    【生产企业】
    企业名称：
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