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布氏菌纯蛋白衍生物

来源:三部   分类:体内诊断类   页码:374  
布氏菌纯蛋白衍生物
Bushijun Chundanbai Yanshengwu
Purified Protein Derivative of Brucellin (BR-PPD)
本品系用布氏菌经培养、杀菌、除去菌振后的上清液制成的纯蛋白衍生物,用于布氏病的临床诊断、布氏菌苗接种对象的选择及布氏菌苗接种后机体免疫反应的监测。 1基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 布氏菌纯蛋白衍生物(BP-PPD)生产车间必须与其他生物制品生产车间及实验室分开。原液生产全部过程,包括布氏杆菌的灭活,应在完全隔离的区域内进行,所需设备及器具均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具,应经过严格清洗及灭菌处理。 2制造 2.1菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.1.1名称及来源 采用猪布氏菌I型CMCC 55007(S2)菌株。 2.1.2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.1.3种子批的传代 自工作种子批启开至菌体收集,传代应不超过5代。 2.1.4种子批的检定 2.1.4.1染色镜检 应为革兰氏阴性小杆菌。 2.1.4.2生化反应 1:1000三胜黄素做变异检查,应为阴性;在硫堇培养基能生长;在碱性复红培养基不生长;在肝斜面培养生长可产生明显的硫化氢,不需二氧化碳。 2.1.4.3血清学特性 生产用菌种对布氏菌参考血清的凝集效价应达到1:800(++)以上。 2.1.4.4噬菌体裂解特性 能被布氏菌Wb噬菌体裂解。 2.1.5种子批的保存 冻干菌种保存于8℃以下,液体菌种保存于-70℃以下。 2.2原液 2.2.1生产用种子 启开菌种后接种于肝琼脂斜面培养基,置37℃培养2~3天,根据生长情况,可在肝琼脂斜面培养基上再传代1次,生长良好的菌苔用于生产。 2.2.2生产用培养基 采用肝浸液琼脂培养基或经批准的其他培养基。 2.2.3接种和培养 取2.2.1项生长良好的菌苔,接种于适量的大管肝斜面或克氏瓶中,置37℃培养2天作为种子,再接种至大管肝斜面或肝琼脂克氏瓶,置37℃培养2天。 2.2.4收获及杀菌 培养终止,以生理氯化钠溶液洗脱培养物,121℃、30分钟杀菌,杀菌后离心除去菌体,收集上清液。如上清液需保存应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的防腐剂,保存于2~8℃,保存期不超过30天。应防止冻结。 2.2.5纯化 收集上清液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质,或采用经批准的方法纯化,除菌过滤后即为原液。 2.2.6合并与分装及冻干 2.2.6.1合并 同批分次纯化的原液可以合并,但不得超过5次。 2.2.6.2分装及冻干 原液检定合格后,可根据蛋白质含量,将原液稀释至规定浓度,定量分装,分装后立即进行冻干。 2.2.7原液检定 按3.1项进行。 2.2.8保存及有效期 原液应保存于2~8℃。液体原液自效价测定合格之日起,有效期为5年;原液冻干品自效价测定合格之日起,每间隔5年应按3.1项进行检定,合格后可继续使用。 2.3半成品 2.3.1配制 经检定合格的原液,用0.01mol/L PBS(pH7.2~7.4,含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚)稀释至10U/ml。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 每瓶1ml、2ml。每1.次人用剂量0.1ml,含BR-PPD 1U。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1外观 原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体,无不溶物或杂质。 3.1.2复溶时间 冻干品按标示量加入注射用水后,应于3分钟内完全溶解。 3.1.3水分 冻干品应不高于3.0%(通则0832)。 3.1.4纯度 3.1.4.1蛋白质含量 依法测定(通则0731第二法)。 3.1.4.2多糖与核酸含量 每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg。 (1)多糖含量测定 以生理氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品,制备0~100μg/ml葡萄糖标准品溶液。将硫酸225ml加入75ml生理氯化钠溶液中,另称取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中,将上述溶液混合,配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度葡萄糖标准品溶液以及本品,加入4.0ml蒽酮混合液,混匀,沸水浴20分钟后在波长620nm处测定吸光度,以葡萄糖标准品溶液浓度对应其吸光度,用Minitab或其他统计学方法求回归方程,代人本品吸光度,计算多糖含量。 (2)核酸含量测定量取供试品2~3ml,采用紫外-可见分光光度法(通则0401),在波长260nm处测定吸光度,按()=200计算核酸含量。 3.1.5效价测定 3.1.5.1动物法 将标准品及本品分别稀释3个不同稀释度,取至少4只经布氏菌致敏的体重为400~600g的白色雌性豚鼠,去毛后于背部脊柱两侧相对部位,分别皮内注射上述稀释度本品各0.1ml或0.2ml,于注射后24小时、48小时各观察局部硬结的纵径与横径(可根据48小时的反应结果判定)。计算每个稀释度2天的硬结反应总和或平均面积,并求其比值,每个稀释度本品与相应浓度标准品的比值应为0.8~1.2,如不符合上述要求,可调整稀释度后再测定效价,直至符合要求。 3.1.5.2稀释度选择 稀释度的选择应能使本品注射后24小时所产生的局部硬结反应直径为10~30mm;本品和标准品的硬结反应直径大小应相似,且本品和标准品的3个稀释度的剂量对数反应曲线应基本平行。如本品效价与标准品效价不一致,可用同样方法复试1次,并算出相当于标准品的效价,进行调整,调整后再重新抽样测定效价,直至符合要求。 3.1.6无菌检查 依法检查(通则1101),应符合规定。 3.1.7异常毒性检查 依法检查(通则1141),应符合规定。 3.1.8致敏效应试验 试验组与对照组分别选用体重300~400g未做过任何试验的豚鼠各3只。试验组每只豚鼠皮内注射0.2ml含20μg的本品,共3次,每次间隔5天。在第3次注射后15天,试验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.2ml含20μg的本品,连续观察3天,两组动物反应应无明显区别。 3.2半成品检定 无菌检查 依法检查(通则1101),应符合规定。 3.3成品检定 3.3.1鉴别试验 取经布氏菌致敏的豚鼠至少4只,皮内注射0.2ml本品,24小时后豚鼠的平均硬结反应直径(纵、横直径相加除以2)均应不小于5mm。 3.3.2物理检查 3.3.2.1外观 应为无色澄明液体,无不溶物或杂质。 3.3.2.2装量 依法检查(通则0102),应不低于标示量。 3.3.3化学检定 3.3.3.1 pH值 应为6.8~7.4(通则0631)。 3.3.3.2苯酚含量应不高于3.0g/L(通则3113)。 3.3.4效价测定 取经布氏菌致敏的400~600g豚鼠,皮内注射0.2ml标准品与本品,至少各4只,注射后24小时、48小时各观察结果1次(可根据48小时的反应结果判定),计算本品和标准BR-PPD的平均硬结反应直径,计算累计值,并求其比值,应为0.8~1.2。 3.3.5无菌检查 依法检查(通则1101),应符合规定。 3.3.6异常毒性检查 依法检查(通则1141),应符合规定。 4保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起,有效期为12个月。 5使用说明 应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。

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